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肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥

因中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)控制骨骼肌運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)元退化導(dǎo)致的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱漸凍人癥)是一種漸進(jìn)且致命的神經(jīng)退行性疾病。由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致大腦完全喪失控制隨意運(yùn)動(dòng)的能力，最終會(huì)造成發(fā)音、吞咽，以及呼吸和運(yùn)動(dòng)障礙。著名物理學(xué)家霍金就是一名ALS患者。目前還沒(méi)有真正可有效治療ALS的藥物和方法。>>>商務(wù)洽談，點(diǎn)此處，在線咨詢

絕大多數(shù)(90-95%)的ALS發(fā)病原因不明，但也有約5-10%的ALS患者表現(xiàn)出了家族遺傳性，其中超氧化物歧化酶 1(Superoxide Dismutase 1：SOD1)基因突變約占這些遺傳性ALS病例的10%。SOD1也是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的ALS風(fēng)險(xiǎn)基因[1]，因此很快就有科學(xué)家構(gòu)建了一種含有第93位甘氨酸突變?yōu)楸彼?G93A)的人SOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠[2]。該轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中被轉(zhuǎn)入了23個(gè)拷貝的人源SOD1*G93A突變基因，接下來(lái)我們將其簡(jiǎn)稱SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是以B6和SJL雜交子代為背景品系，通過(guò)原核注射和胚胎移植得到的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，因此其毛色多樣，圖片來(lái)自Jax實(shí)驗(yàn)室(https://www.jax.org/strain/002726)

自1996年SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠問(wèn)世以后，其就被廣泛應(yīng)用于ALS藥物研發(fā)的臨床前動(dòng)物試驗(yàn)中。到2004年，短短8年時(shí)間內(nèi)，已至少有50篇文章描述了從小分子到病毒載體的各類ALS治療方案，可延長(zhǎng)SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命，其中最長(zhǎng)可以延長(zhǎng)壽命100天(78%的壽命延長(zhǎng))。這些藥物很快進(jìn)入臨床試驗(yàn)，然而，迄今為止，除了利魯唑(最多延長(zhǎng)ALS患者兩個(gè)月壽命)之外，沒(méi)有任何一種藥物顯示出對(duì)人類ALS疾病的進(jìn)程有顯著影響[3]。這給醫(yī)藥公司帶來(lái)了巨大損失，如2008年在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊上發(fā)表的一篇文章顯示鋰可以將SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的存活時(shí)間延長(zhǎng)30天[4]。由于鋰早已經(jīng)被用于治療精神分裂癥，許多ALS患者開(kāi)始超說(shuō)明書(shū)服用該藥物，希望減緩疾病進(jìn)程。然而，招募了數(shù)百名患者，花費(fèi)了遠(yuǎn)超1億美元的三個(gè)同時(shí)啟動(dòng)的獨(dú)立III期臨床試驗(yàn)結(jié)果卻顯示鋰對(duì)ALS無(wú)任何治療效果。

其實(shí)不僅僅是ALS的藥物研發(fā)，在整個(gè)醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均臨床轉(zhuǎn)化率也是非常低的，平均在11%左右 。那么到底是什么原因?qū)е铝巳绱烁弑壤膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法實(shí)現(xiàn)在人類的臨床轉(zhuǎn)化呢?

1999年，美國(guó)麻省理工學(xué)院的機(jī)械工程師詹姆斯·海伍德在得知他的哥哥史蒂芬·海伍德被確診患有ALS，并無(wú)任何有效治療方法后，與家人一起創(chuàng)立了一家非盈利性生物技術(shù)公司，即ALS 治療開(kāi)發(fā)研究所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立后開(kāi)展了一項(xiàng)旨在尋找SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化失敗原因的項(xiàng)目，即使用SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠重復(fù)已發(fā)表科研論文中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以找出其臨床轉(zhuǎn)化失敗的原因。

在ALS-TDI開(kāi)展的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，他們不僅嚴(yán)格執(zhí)行盲法對(duì)照，而且對(duì)給藥組和對(duì)照組的動(dòng)物進(jìn)行了更為精細(xì)的分配和動(dòng)物篩查以排除系統(tǒng)誤差。他們分組及實(shí)驗(yàn)要求包括：

⑴ 年齡匹配;

⑵ 性別匹配;

⑶ 同窩匹配：即使用同一天出生的同一非轉(zhuǎn)基因母親和轉(zhuǎn)基因父親的后代進(jìn)行分組，具體來(lái)說(shuō)，治療組中的每個(gè)雄性(和雌性)在對(duì)照組中都有一個(gè)同窩兄弟(和姐妹);

⑷ 樣本量設(shè)定：每組使用動(dòng)物數(shù)量為24只(12雌，12雄);

⑸ 死因篩查：檢查記錄每一只動(dòng)物的死亡原因，排出非ALS致死個(gè)體;

⑹ 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)監(jiān)控：有研究證明SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在傳代過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)丟失的現(xiàn)象，且低拷貝的轉(zhuǎn)基因小鼠的平均壽命會(huì)加長(zhǎng)。

在這一嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物篩查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使用了5429只SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠測(cè)試了包括利魯唑在內(nèi)的100多種(大部分已有論文發(fā)表并證明可延長(zhǎng)SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠壽命)候選化合物，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任一化合物表現(xiàn)出可延長(zhǎng)SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠壽命的效果(圖三)。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)展的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已發(fā)表實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比[3]

為找出導(dǎo)致那些已經(jīng)發(fā)表實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法被重復(fù)的原因，他們以在ALS-TDI開(kāi)展實(shí)驗(yàn)中所使用的2000多只對(duì)照小鼠作為研究對(duì)象，進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分組模擬實(shí)驗(yàn)。由于這些小鼠從出生到死亡及死亡原因的信息在ALS-TDI都有詳細(xì)的記錄，因此他們能夠以所有對(duì)照小鼠為數(shù)據(jù)庫(kù)，分析前述重復(fù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的不同分組和動(dòng)物篩查條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。即通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)這些沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何藥物處理的小鼠進(jìn)行分組，將一組設(shè)為假定的實(shí)驗(yàn)組，而另一組設(shè)為假定的對(duì)照組，然后依據(jù)已有的小鼠死亡時(shí)間記錄，統(tǒng)計(jì)兩組小鼠之間是否存在顯著差異。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，計(jì)算出現(xiàn)5%以上顯著差異的百分比。由于這些對(duì)照小鼠沒(méi)有接受過(guò)任何化合物處理，因此如果假定的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中出現(xiàn)了顯著性差異，那么其來(lái)源應(yīng)該是分組時(shí)的系統(tǒng)誤差。

結(jié)果顯示，在樣本量大小為4的計(jì)算機(jī)分組模擬對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，在隨機(jī)分組和不進(jìn)行死因篩查及排除低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)個(gè)體條件下，兩組間出現(xiàn)顯著差異的可能性超過(guò)了50%。而隨機(jī)分組的同時(shí)進(jìn)行死因篩查并排除低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)個(gè)體和進(jìn)行性別匹配的分組條件下，樣本量為4的模擬分組實(shí)驗(yàn)中也有30%的可能出現(xiàn)兩組死亡時(shí)間的顯著差異(圖四)。隨著樣本量的增加，出現(xiàn)顯著性差異的可能性逐漸減少，但要實(shí)現(xiàn)低于5%(統(tǒng)計(jì)學(xué)上通常設(shè)置的顯著置信區(qū)間)的顯著性差異，樣本量要達(dá)到每組24只動(dòng)物。如果不做分組條件控制，即使樣本量到50只也難以排除系統(tǒng)誤差。

圖四：分組條件導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差[3]

ALS- TDI的這個(gè)計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，前述那些已經(jīng)發(fā)表的基于SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的真正原因極大可能源于其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不合理。這些實(shí)驗(yàn)因?yàn)闆](méi)有排除分組時(shí)的系統(tǒng)誤差而導(dǎo)致了假陽(yáng)性結(jié)果。這個(gè)研究也暴露了當(dāng)下使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)展研究的諸多問(wèn)題，如盲目地追求減少使用動(dòng)物的數(shù)量;對(duì)所用動(dòng)物遺傳、微生物和繁殖等特性不了解;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物關(guān)注不夠，不清楚動(dòng)物發(fā)病或死亡的真正原因等。這些問(wèn)題不僅僅需要引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員的注意，科研人員同樣需要給予關(guān)注。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果不僅是人力、物力和財(cái)力的巨大浪費(fèi)，也嚴(yán)重有違動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理福利，這樣的實(shí)驗(yàn)不會(huì)帶來(lái)科學(xué)進(jìn)步，且浪費(fèi)了大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生命。比如在ALS-TDI開(kāi)展的無(wú)法重復(fù)出已發(fā)表結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中，那些已經(jīng)發(fā)表的工作累計(jì)使用小鼠的數(shù)量就超過(guò)了18000只。此外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理申請(qǐng)時(shí)常用替代、優(yōu)化和減少(俗稱3R原則)原則來(lái)指導(dǎo)倫理審查工作，有時(shí)為了滿足3R原則中的“減少”原則，加上開(kāi)展實(shí)驗(yàn)成本的考慮，往往選擇使用最少的動(dòng)物數(shù)量(比如多為每組6只)，但從ALS-TDI的這個(gè)研究看，樣本量過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)誤差加大，因此極大可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。這個(gè)時(shí)候大家或許忘了3R原則使用的大前提是要能夠?qū)崿F(xiàn)擬開(kāi)展實(shí)驗(yàn)的科學(xué)目標(biāo)，如果單純?yōu)榱恕皽p少”而使用更少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物導(dǎo)致科學(xué)目標(biāo)無(wú)法實(shí)現(xiàn)，那不是減少，而是對(duì)動(dòng)物生命的漠視。

來(lái)源：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物那些事兒

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